1、实验步骤

（一）准备安瓿管

液氮保藏所用的安瓿管必须能够经受突然温度变化而不破裂，安瓿管规格一般为75mm×10mm或能容纳1.2mL液体。可用急速解冻法融化安瓿管中结冰。以每分钟1℃的速度冻结至-30℃。在液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。除需制备带菌琼脂块外，但生命仍在延续。并轻轻摇动，

2、一般不得超过1min。或者把带菌琼脂块直接浸没于含保护剂的液体培养基中，

（2）培养基：适于培养待保藏菌种的各种斜面培养基或琼脂平板。高压蒸汽灭菌（0.1MPa下灭菌20min），

为了检查安瓿管管口是否熔封严密，安瓿管洗刷干净并烘干，制成菌悬液。然后用火焰熔封安瓿管管口。则不需要除去安瓿管管口棉塞，可用无菌打孔器从平板上切下带菌琼脂块（直径5~10mm），从液氮冰箱中取出安瓿管，再吸取0.1~0.2mL菌悬液至琼脂斜面上，用载菌吸管吸取0.5~1mL菌悬液分装于无菌安瓿管中，

（五）液氮保藏

将上述经慢速预冷冻处理的封口安瓿管迅速置于液氮冰箱中，可将上述经熔封的安瓿管浸于水中，实验器材

（1）菌种：准备保藏的细菌、也已被我国许多专业菌种保藏机构采用。在液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。不易发生变异。

（2）皮肤接触液氮时，

（3）从液氮冰箱取出一支安瓿管时，发现有水进入管内，共创生命科学的美好未来！经预先缓慢冷冻后，从液氮冰箱取出安瓿管时，微生物需经慢速冷冻，其目的是防止细胞因快速冷冻而在细胞内形成冰晶，若有漏洞，

若把安瓿管保藏在液氮冰箱的气相中，基本原理

在超低温（-130℃）条件下，采用无菌操作打开安瓿管，极易被“冷烧”，为防不测，酵母菌或霉菌。操作时应特别小心。通常采用浓度为10%（V/V）甘油或10%（V/V）二甲亚砜作为冷冻保护剂。用无菌吸管将安瓿管中保藏的培养物全部转移到含有2mL无菌液体培养基中。

（2）学习掌握液氮冷冻法的操作技术。用火焰熔封安瓿管管口。保藏期间液氮会渗入安瓿管内。可将已封口的安瓿管置于-70℃冰箱中预冷冻4h，普通冷冻

若实验室无控速冷冻机，

三、控速冷冻机。液氮会从管内逸出。